所属栏目：药学论文范文发布时间：2026-06-15浏览量:675
摘 要 目的:采用谱效方法研究地稔抗糖氧剥夺再灌注(OGD/ R)的药效物质｡方法:应用SH - SY5Y 的OGD/ R 模型,对地稔12 个不同提取物活性进行筛选;结合高效液相色谱建立指纹图谱;利用偏最小二 乘法(PLS)及灰色关联(GRA)联合分析色谱峰与抑制LDH 释放及促进细胞增殖作用的谱效关系｡结 果:给药浓度为10､100､300 mg/ L 地稔提取物,12 种提取物均具有显著抑制LDH 释放作用,其中抑制效 果最好的为水煎液300 mg/ L;50% 乙醇提取物及正丁醇提取物可使细胞活力显著升高｡建立了24 个色 谱峰的地稔不同提取物高效液相指纹图谱｡谱效关系研究发现,地稔提取物中峰3､1(没食子酸)､18､2 (原儿茶酸)､15(芦丁)具有潜在的抗OGD/ R 的活性,细胞实验验证芦丁､原儿茶酸､没食子酸抑制OGD/ RSH - SY5Y 细胞的LDH 释放能力,增强细胞活力｡结论:通过谱效从地稔中得到5 个抗OGD/ R 的药效 物质,包括芦丁､原儿茶酸､没食子酸。
关键词 地稔;糖氧剥夺再灌注;谱效关系;SH - SY5Y 细胞;活性成分
论文《基于谱效关系的畲药地稔抗糖氧剥夺再灌注活性成分研究》发表在《中国中医药科技》，版权归《中国中医药科技》所有。本文来自网络平台，仅供参考。
地稔, 畲药名嘎狗噜, 是野牡丹科植物地稔 Melastoma dodecandrum Lour. 的干燥地上部分,分布 于浙江､福建､湖南等地｡地稔具有清热解毒､活血 止血的功效,临床可用于治疗崩漏､消化道出血[1], 以及肝炎､肝肿大､肾盂肾炎[2],其主要含有脂肪 酸､有机酸､多糖､挥发油､黄酮､鞣质､三萜､甾体等 化学成分,具有抗氧化､降血糖､降血脂､抗炎镇痛､ 止血凝血､抑菌等多种药理作用[3]｡已有文献报道 地稔预处理对于肢体缺血再灌注损伤具有较好的 保护作用,通过地稔预给药后再进行手术,可显著 改善大鼠凝血功能的紊乱,减少血液中炎症因子的 表达[4],在临床上,地稔组方在急性缺血性脑卒中 (AIS)后72 h 内给药,有助于降低炎症因子的释放, 提高AIS 患者生活独立能力和促进神经功能恢复, 从而改善卒中预后,降低致残率[5],但地稔抗缺血 再灌注的物质基础至今尚不明确｡因此本实验基 于糖氧剥夺的SH - SY5Y 细胞模型,结合高效液相 色谱法, 通过偏最小二乘法( PLS) 及灰色关联 (GRA),将地稔95% ､80% ､70% ､60% ､50% ､30% 乙醇提取物､水提取物及石油醚､三氯甲烷､乙酸乙 酯､正丁醇萃取物的特征峰与药效之间进行相关性 分析,得到地稔抗OGD/ R 的药效物质,为地稔的临 床用药和药效物质基础研究提供科学依据｡
1 实验材料
地稔中药饮片:由丽水市中医院中药库提供, 经本单位中药饮片验收小组验收均符合2015 年版 中国药典的相关规定｡没食子酸(批号:110831 - 201906, HPLC ≥98 %) 、原儿茶酸(批号:110809201906, HPLC ≥97.7 % )、异荆素(批号:111687202105, HPLC ≥99.1 % )、异丁(批号:100080 - 202012, HPLC ≥91.6 % )、篇皮素(批号:100081201610, HPLC ≥99.8 % ),芹菜素(批号:111901202004, HPLC ≥99.4 % ):中国食品药品检定研究 院;荭草苷(批号:, HPLC ≥98 % )、牡 牡荆素(批号:, HPLC ≥98 % )、芦蓄 苷(批号:, HPLC ≥98 % ):上海源叶; SH - SY5Y:普诺赛有限公司｡
甲醇､乙腈(色谱级):上海星可高纯试剂有限 公司;氯仿､石油醚､乙醚､乙酸乙酯､正丁醇､甲醇 均为分析纯;DMEM/ F12 高糖培养液:普诺赛有限 公司;胎牛血清:以色列BI 公司;乳酸脱氢酶细胞毒 性检测试剂盒:碧云天,C0017;CCK - 8 试剂:Biosharp 公司｡
高速多功能粉碎机:浙江省永康市金机械制造 厂;Waters e2695 高效液相色谱仪(配置Waters 2998 紫外检测器､Empower 3 Personal Single System SW 化学工作站):美国Waters 公司;一体式超净水机: Thermo Electron Led GmbH;十万分之一电子分析天 平:上海良平仪器仪表有限公司;TC - 15 恒温电热 套: 海宁市华星仪器厂; 酶标仪: Thermo 公司; CKX53X 显微镜:奥林巴斯;二氧化碳培养箱:Thermo 公司;厌氧产气袋:日本三菱｡
2 方法
2. 1 不同极性地稔提取物制备 称取地稔药材 100 g,分别用8 倍量(mL/ g) 不同浓度乙醇和水回 流提取2 次,每次2 h,滤过,合并滤液,减压浓缩,减 压干燥,得地稔7 种提取物,记为S1 ~ S7｡称取地 稔药材,8 倍量95% 乙醇､50% 乙醇各回流提取 1 次,每次2 h,滤过,合并滤液,浓缩至无醇味,加水 稀释至0. 5 g / mL 药材溶液,依次用石油醚､三氯甲 烷､乙酸乙酯､正丁醇萃取,得到产物减压回收,干 燥,即得地稔5 种提取物,记为S8 ~ S12｡
2. 2 地稔提取物抗OGD/ R 活性成分筛选
2. 2. 1 LDH 释放量测定 细胞接种于培养板中, 培养24 h 后,更换为无糖Earle’s 液,将细胞缺氧缺 糖培养6 h,氧复糖24 h,收集复氧上清液｡到达预 定时间后,按试剂盒说明书操作｡
2. 2. 2 细胞活力检测 取对数生长期的SH - SY5Y细胞,消化计数后制成 5 ×10⁵ / mL 细胞悬液, 96 孔板中每孔加入100 μL 细胞悬液,将孔板置于 4°C,5% CO₂ 培养箱中培养｡给药处理 后,向 每孔加入CCK - 8 溶液,在培养箱内孵育30 min｡ 用酶标仪测定在450 nm 处的吸光度｡细胞活力 (% ) = [A( 加药) - A( 空白)] / [ A(0 加药) - A (空白)] × 100% [A(加药):具有细胞､CCK - 8 溶 液和药物溶液的孔的吸光度;A(空白):具有培养基 和CCK - 8 溶液而没有细胞的孔的吸光度;A(0 加 药):具有细胞､CCK - 8 溶液而没有药物溶液的孔的吸光]｡
2. 3 不同地稔提取物指纹图谱的建立
色谱柱:Waters × Xbridge C18 柱(250 mm × 4. 6 mm,5μm);流速:1. 0 mL/ min;进样量:10 μL;柱温: 30 ℃;流动相:甲醇(A) - 混合水溶液(含有0. 3% 磷酸和0. 1% 四氢呋喃)(B);梯度洗脱:0 ~ 20 min, 2% A ￫2% A;20 ~ 50 min,2% A ￫20% A;50 ~ 85 min,20% A￫30% A;85 ~ 120 min,30% A￫55% A;120 ~ 130 min,55% A￫2% A);检测波长254 nm｡
对照品溶液制备:精密称取对照品,加入甲醇 并定容至10 mL,得对照品储备液｡精密移取各对 照品储备液适量,甲醇并定容至10 mL,制得对照品 混标溶液｡
供试品溶液制备:取1 g 地稔样品于200 mL 圆 底烧瓶,精密加入80% 乙醇50 mL,回流提取2 h,蒸 干溶剂,后加入甲醇溶解,过0. 22μm 滤膜即得｡
2. 4 抗OGD/ R 活性成分辨识
将地稔提取物的谱峰进行积分,结合抗OGD/ R 活性实验数据,组成数据集并导入到SIMCA 14. 1 软件, 建立PLSR 模型; 采用MATLAB2022a 进行 GRA 分析,寻找地稔中抗OGD/ R SH - SY5Y 细胞 模型中促进细胞增殖､抑制LDH 释放的活性成分｡
2. 5 统计学方法 实验结果采用Graph Pad Prism 5 统计学软件分析,组间数据比较采用单因素方差 分析, P<0.05 为差异有统计学意义｡
3 结果
3. 1 OGD/ RSH - SY5Y 细胞模型建立 根据CCK 法检测 细胞增殖活性, 与未缺糖缺氧组相比,缺糖缺氧1､2､3､6､9､12､18､ 24h细胞存活率均显著下降 (P<0.01) ,其中6h 时,细胞活力为60% ,因此后续建立脑缺血再灌注 细胞模型的缺糖缺氧时间点为6 h｡
3. 2 不同地稔提取物给药浓度的确定 实验结果 显示,地稔水煎液､50% 乙醇提取物､80% 乙醇提取 物､石油醚､氯仿､乙酸乙酯､正丁醇萃取无毒性, 30% ､60% ､70% 乙醇提取地稔在300 mg / L 及以下 浓度无毒,因此确定给药浓度为300､100､10 mg / L｡
3. 3 不同地稔提取物对OGD - R SH - SY5Y 细胞 LDH 释放的影响 与正常对照组比较,模型组LDH 释放显著升高 (P<0.01) 与模型组比较,水煎液及 30% ､50% ､60% ､70% ､80% ､95% 乙醇提取物和石 油醚､氯仿､乙酸乙酯､正丁醇､萃水提取物组LDH 释放抑制显著( P<0.05 、 P<0.01 ),其中抑制效果 最好的为水煎液300 mg / L,LDH 释放量为1. 29｡
3. 4 不同地稔提取物对OGD - RSH - SY5Y 细胞 增殖的影响 与正常对照组比较,模型组细胞活力 显著降低 (P<0.01) 与模型组比较, 乙醇提取 物及正丁醇提取物组细胞活力显著升高( P<0.05 、 P<0.01 ),其中 乙醇 地稔的细胞活 力为69. 59% ｡
3. 5 不同地稔提取物指纹图谱的建立 根据标准 品光谱核对地稔样品峰,最终确定在8. 13 min 为没 食子酸,18. 2 min 为原儿茶酸,69. 0 min 为异荭草 素,73. 716 min 为牡荆素,79. 2 min 为异牡荆素, 82. 3 min 为芦丁,90. 3 min 为萹蓄苷,103. 7 min 为 槲皮素,114. 4 min 为芹菜素｡确定地稔指 纹图谱的峰1 为没食子酸,峰2 为原儿茶酸,峰10 为异荭草素,峰11 位牡荆素,峰14 为异牡荆素,峰 15 为芦丁｡
3. 6 地稔抑制OGD/ R SH - SY5Y 释放LDH 作用 谱效关系的建立 将指纹图谱各色谱峰的峰面积 作为自变量,LDH 释放量作为因变量,采用SIMCA 14. 1 软件对其进行偏最小二乘回归分析, 得到 24 个特征峰与抑制率的标准化回归系数 和 值｡ VIP >1 时,自变量在解释因 变量时具有重要意义｡其中峰3､13､1､12､15､的 VIP 值均大于1(按VIP 值从大到小排列),且回归 系数为正相关,表明该物质对于抑制SH - SY5Y 释 放LDH 有重要作用｡
将LDH 释放量作为参考序列,指纹图谱各色谱 峰的峰面积作为比较序列,得到地稔对OGD/ R 模 型LDH 释放量的灰色关联度(r)｡峰18､12､15､4､ 19、5、3、21、17、16的 r 值均大于0.8。
3. 7 地稔促进OGD/ R SH - SY5Y 细胞增殖作用谱 效关系的建立 将指纹图谱各色谱峰的峰面积作 为自变量,细胞活力作为因变量,采用SIMCA 14. 1 软件对其进行偏最小二乘回归分析｡峰3､1､2､17､20､23､6､24 的VIP 值均大于1(按VIP 值从大到小 排列),且其回归系数均为正相关｡
将细胞活力作为参考序列,指纹图谱各色谱峰 的峰面积作为比较序列,峰4､3､18､4､12､19､15､ 16、2、1、21、5、11、17、10的 r 值均大于｡
PLSR 和GRA联合比较 将 VIP >1 和 r ≥0.8 的色谱峰整合,得到重叠的色谱峰,与LDH 释放及 细胞活力最相关的为峰3,说明峰3 对应的成分对 于地稔抑制OGD/ R 的SH - SY5Y 的LDH 释放级细 胞活力有重要影响｡
3. 8 芦丁､原儿茶酸､没食子酸给药浓度确定及其 对OGD - RSH - SY5Y 细胞活力的影响
与正常对照组相比,300 mg / L 芦丁及30 mg / L 原儿茶酸对SH - SY5Y 细胞促进增殖,20 mg/ L 没食子酸对细胞有损伤;与模型组相比,不同浓度芦丁､ 原儿茶酸对OGD/ RSH - SY5Y 均具有促进增殖作 用 (P<0.05) ,20g/L没食子酸对OGD/RSH - SY5Y无显著增殖作用 (P>0.05) ,4、2、1 mg/L没食 子酸对 均具有促进增殖作用( P <0.01 )。
3. 10 芦丁､原儿茶酸､没食子酸对OGD - R SH - SY5Y 细胞LDH 释放的影响 与正常对照组 相比,OGD/ R 的SH - SY5Y 细胞LDH 释放显著增 加 (P<0.01) 与模型组相比,不同浓度芦丁､原儿 茶酸及没食子酸对OGD/ R 的SH - SY5Y 均具有抑 制 释放作用 (P<0.05) 。
4 讨论
本研究采用不同极性的乙醇提取地稔,得到12 种不同提取物｡通过HPLC 建立地稔指纹图谱,得 到24 个特征峰,确定峰1 为没食子酸,峰2 为原儿 茶酸,峰10 为异荭草素,峰11 位牡荆素,峰14 为异 牡荆素,峰15 为芦丁｡选择人神经母细胞瘤细胞 (SH - SY5Y) 并建立氧糖剥夺再灌注( OGD/ R) 模 型,以模拟缺血缺氧所致的神经细胞损伤｡根据12 种地稔提取物对OGD/ R SH - SY5Y 细胞的细胞活力及LDH 释放量的影响,明确有效提取部位,其中 50% 乙醇的300 mg / L 地稔提取物可以显著促进细 胞活力,地稔水煎液300 mg / L 可以显著抑制LDH 释放｡结合PLSR 及GRA 分析得到有效成分,将 VIP >1 和 r ≥0.8 的色谱峰整合,与 释放及细 胞活力相关的为峰3(未知成分)､1(没食子酸)､18 (未知成分)､2(原儿茶酸)､15(芦丁),其中峰3 对 应的成分对于地稔抑制OGD/ R SH - SY5Y 的LDH 释放及细胞活力有重要影响｡
脑缺血再灌注损伤在中医上属于“中风” 的范 畴[6],前期研究表明,地稔中含有较多的黄酮类成 分[7 - 9],且地稔具有显著的清除氧自由基效果[10],可能是黄酮类成分通过改善脑缺血再灌注导致的 氧化应激损伤,进而起到治疗作用｡中药谱效主要 包括指纹图谱､药效评价和谱效相关性[11 - 13]｡PLS 适合不同极性部位,GRA 分析适合样本量小,多组 的实验,故用于本实验谱效关系的研究[14]｡
综上,本研究通过HPLC 建立地稔提取物的指 纹图谱,以氧糖剥夺再灌注的SH - SY5Y 细胞为模 型,结合PLS 及GRA 的相关性分析,得出地稔的谱 效关联性,峰3(未知成分)､1(没食子酸)､18(未知 成分)､2(原儿茶酸)､15(芦丁) 对抑制OGD/ R 的 SH - SY5Y 的LDH 释放及细胞活力的主要药效成 分,初步衡量各成分对药效的贡献程度｡为研究地 稔抗脑卒中药效物质基础提供依据｡
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