所属栏目：作物生产科学论文范文发布时间：2026-02-13浏览量:521
为探究核桃膳食纤维对乳杆菌生长的潜在作用，分别添加不同质量浓度的膳食纤维(0.1~3.2g/L)到MRS培养基中，比较其对10种乳杆菌生长的影响，以筛选出最佳的“纤维+菌种”组合进行增殖作用研究。结果表明，核桃不溶性纤维仅对植物乳植杆菌生长有促进作用，促进率最高为9.95%，对其它9种乳杆菌均有抑制作用。核桃可溶性纤维对唾液联合乳杆菌促进率最高，达44.34%，其次是植物乳植杆菌(16.14%)和干酪乳酪杆菌(11.23%)。
进一步研究发现，核桃可溶性纤维可显著提高唾液联合乳杆菌的生物量、活菌数和非特异性粘附能力(*P*<0.05)，在纤维添加量为3.2g/L时，生物量和活菌数分别提高2.86倍和7.28倍，表面疏水性提高8.81%;显著促进其生物膜的形成(*P*<0.05);显著提高唾液联合乳杆菌对糖源的利用，并降低发酵液的pH值(*P*<0.05)，在纤维添加量为3.2g/L时，发酵液的pH值最低，为3.74。此外，核桃可溶性纤维还可显著升高唾液联合乳杆菌β-半乳糖苷酶和乳酸脱氢酶的活性(*P*<0.05)。
结论：核桃可溶性纤维可通过提高唾液联合乳杆菌的β-半乳糖苷酶和乳酸脱氢酶的活性来促进增殖，且有利于促进其黏附性与生物膜的形成。本研究结果为核桃膳食纤维作为新型益生元提供了理论参考，为其综合开发利用提供了新思路。
关键词：核桃膳食纤维;乳杆菌;增殖作用
论文《核桃膳食纤维对乳杆菌属微生物体外增殖的影响》发表在《中国食品学报》，版权归《中国食品学报》所有。本文来自网络平台，仅供参考。
引言
乳杆菌是一类能够发酵碳水化合物产生乳酸的常见益生菌，广泛存在于人体胃肠道中，在抵抗肠道致病菌感染、增强肠道上皮功能、免疫调节、抗癌等方面发挥重要作用。在体内，乳杆菌的数量受宿主遗传、年龄、疾病状态、饮食、黏附能力、乳酸分泌、胃酸与胆盐耐受性等因素影响;在体外，其增殖则受菌龄、碳源、氮源、pH值的影响。乳杆菌被广泛用于发酵食品中，筛选高效的乳杆菌增殖剂对实际生产具有重要意义。
唾液联合乳杆菌(*Ligilactobacillus salivarius*，*L.salivarius*)是同型发酵乳酸菌，可通过提高α-半乳糖苷酶基因表达增加棉子糖利用以促进增殖，其含有的β-半乳糖苷酶、乳酸脱氢酶及碳水化合物利用基因，使其能发酵多种糖类，同时具备抗微生物、免疫调节、调节肠道菌群等功效，但目前应用较少，或与培养、干燥等稳定性问题相关，需进一步研究。
膳食纤维是不能被人体小肠消化吸收的碳水化合物，分可溶性和不溶性两类，在肠道内可被菌群发酵为短链脂肪酸，且诸多研究表明其能促进乳杆菌增殖、提高发酵活力。核桃富含不饱和脂肪酸、蛋白质及膳食纤维，酶法制备的核桃膳食纤维更能保持结构或提升黏度，且核桃水溶性膳食纤维可改善高脂饮食引起的肠道微生物紊乱，但鲜见核桃膳食纤维影响乳杆菌属微生物生长的相关报道。为此，本研究采用纯培养方法，系统评价核桃可溶与不溶性膳食纤维对10种乳杆菌属微生物的增殖作用，并探究其促增殖因素，为核桃资源综合利用提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 菌株
10种均购自中国工业微生物菌种保藏中心(CICC)且应用于食品工业的乳杆菌：干酪乳酪杆菌(*Lacticaseibacillus casei*)、嗜酸乳杆菌(*Lactobacillus acidophilus*)、鼠李糖乳酪杆菌(*Lactiaseibacillus rhamnosus*)、瑞士乳杆菌(*Lactobacillus helveticus*)、唾液联合乳杆菌(*Ligilactobacillus salivarius*)、约氏乳杆菌(*Lactobacillus johnsonii*)、罗伊氏粘液乳杆菌(*Limosilactobacillus reuteri*)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(*Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus*)、发酵乳杆菌(*Lactobacillus fermentum*)、植物乳植杆菌(*Lactplantibacillus plantarum*)。
1.2 材料与试剂
核桃(云南省大理州漾濞县);MRS肉汤培养基、琼脂粉、3,5-二硝基水杨酸、碱性蛋白酶、风味蛋白酶、酸性蛋白酶(北京索莱宝科技有限公司);α-淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶(美国Sigma公司);结晶紫、二甲苯、2-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷、邻硝基苯酚、丙酮酸钠、还原型辅酶1二钠、戊二醛、苯酚、葡萄糖(上海阿拉丁生化科技股份有限公司);无水乙醇(天津市致远化学试剂有限公司);氯仿(成都市科隆化学品有限公司);硫酸(重庆川东化工(集团)有限公司);酒石酸钾钠、乙酸乙酯、氢氧化钠等(成都金山化学试剂有限公司);所有化学试剂均为分析纯级。
1.3 仪器与设备
EPOCH2酶标仪(美国伯腾仪器有限公司);DZF6020真空干燥箱(巩义市予华仪器有限责任公司);PB-10 pH计(梅特勒托利多仪器(上海)有限公司);XO-650D超声细胞破碎仪(南京先欧仪器制造有限公司);YXQ-LS-100SII高压灭菌锅(江阴滨江医药设备有限公司);KLCZ-880A超净工作台(北京亚泰科隆仪器技术有限公司);YQX-II厌氧培养箱(上海龙跃仪器设备有限公司);LC4017离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)。
1.4 方法
1.4.1 核桃可溶性与不溶性纤维的制备
将脱脂核桃经α-淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶处理后，依次经碱性蛋白酶、风味蛋白酶、酸性蛋白酶去蛋白，4000 r/min离心15 min，残渣为核桃不溶性纤维，上清液经95%乙醇沉淀为核桃可溶性纤维;制备得到的纤维经冷冻干燥后备用。
1.4.2 生长曲线的绘制
参考罗开莲等方法，采用1%的接种量将各种乳杆菌接种在MRS液体培养基中，置于37℃培养箱中24h，间隔2h连续测定OD₆₀₀ₙₘ值。
1.4.3 菌种活化
参考罗开莲等方法，从-80℃取出菌种，融化后取1mL菌液加入9mL MRS培养基中，12h培养计为1代，连续传代3次后用于正式试验。
1.4.4 核桃膳食纤维对10种乳杆菌生长的影响
配制含3.2g/L核桃膳食纤维的MRS培养基，稀释至1.6、0.8、0.4、0.2、0.1g/L，灭菌备用;接种1%的乳杆菌至不同浓度培养基中，37℃培养12h后测定OD₆₀₀ₙₘ值，以不接菌的培养基为对照。核桃膳食纤维对乳杆菌生长的促进率按公式(1)计算：
[促进率 (\%)=frac{X_{i}-C_{w}-left(X_{0}-C_{m} ight)}{left(X_{0}-C_{m} ight)} × 100 quad (1)]
式中：(X_0)为接种菌液未做纤维处理的培养基培养12h的吸光度;(X_i)为核桃膳食纤维处理12h的吸光度;(C_m)为MRS纯培养基培养12h的吸光度;(C_w)为对应浓度核桃纤维样品处理12h的吸光度。
1.4.5 核桃可溶性膳食纤维对唾液联合乳杆菌增殖作用的评价
1.4.5.1 生物量的测定
参照谢翠娜的方法，将1%的唾液联合乳杆菌分别接种于0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2g/L的核桃可溶性纤维液体培养基中，厌氧培养12h后，4000r/min离心20min收集菌体，用灭菌PBS清洗3次，将菌体干燥至恒重后称重记录。
1.4.5.2 平板计数法测定活菌数
将培养12h的不同纤维浓度乳杆菌菌悬液梯度稀释后，涂布到MRS固体培养基中，37℃厌氧培养48h后计数。
1.4.5.3 生物膜的测定
参照杜文芳的方法，将1%唾液联合乳杆菌接种到不含/含3.2g/L核桃可溶性纤维的MRS液体培养基中，37℃厌氧培养12h，弃菌液并以PBS清洗2次，37℃通风干燥30min，用0.1%结晶紫溶液染色15min，弃染色液并冲洗残留，干燥、乙醇脱色后测定OD₅₉₅ₙₘ值。
1.4.5.4 表面疏水性和酸碱电荷的测定
参考Samot等的方法，1%唾液联合乳杆菌接种MRS培养基厌氧培养12h，4℃、10000×g离心10min收集菌体，用PBS稀释至OD₆₀₀ₙₘ为0.6±0.2(记为(A_0));取1.5mL稀释菌液加0.5mL二甲苯，室温孵育10min、振荡2min、静置20min，测定水相吸光度(记为(A_1))。表面疏水率按公式(2)计算，酸碱电荷测定仅将二甲苯替换为氯仿/乙酸乙酯，计算方法同公式(2)：
[表面疏水率或酸碱电荷 (\%)=frac{A_{0}-A_{1}}{A_{0}} × 100 quad (2)]
1.4.5.5 pH值的测定
采用pH酸度计，分别测定不同纤维添加量培养12h、0/3.2g/L纤维添加量不同培养时段培养液的pH值。
1.4.5.6 菌液中总糖含量的测定
采用苯酚硫酸法，以葡萄糖为标准品绘制标准曲线，测定不同培养阶段(0、6、12、24、48h)菌液的总糖含量。
1.4.5.7 菌液中还原糖含量的测定
采用3,5-二硝基水杨酸比色法(DNS)，以葡萄糖为标准品绘制标准曲线，测定不同培养阶段(0、6、12、24、48h)菌液的还原糖含量。
1.4.5.8 乳酸脱氢酶的测定
参照李琦的方法，取0、3.2g/L核桃膳食纤维处理的培养液各10mL，4000 r/min离心10min去上清，加10mL PBS冰浴超声破碎，10000r/min离心10min获粗酶液;连续测定反应过程中OD₃₄₀ₙₘ，将吸光度降低量(Delta A)转换为酶活。1个酶活单位定义为25℃时每毫升酶液每分钟氧化1μmol/L NADH所需的酶，酶活力按公式(3)计算：
[乳酸脱氢酶 (U / mL)=frac{V_{1} × Delta A}{6.22 × V_{s}} quad (3)]
式中：(V_s)为测试样品的体积(mL);(Delta A)为每分钟吸光度的降低值;(V_1)为反应总体积(mL)。
1.4.5.9 β-半乳糖苷酶的测定
参照孟鸽的方法并稍作修改，分产酶诱导、粗酶液制备、酶活测定三步：取0、3.2g/L核桃可溶膳食纤维处理12h的菌液各5mL，以1%乳糖为诱导剂37℃培养1h;4000 r/min离心10min，PBS洗涤菌体后加5mL PBS冰浴超声破碎;以PBS配制2mg/mL的2-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷为底物，0.5mL底物37℃预热10min后加0.5mL酶液，37℃反应15min，加0.15mol/L的(Na_2CO_3)溶液2.5mL终止反应，测定OD₄₂₀ₙₘ值;以邻硝基苯酚为标准品绘制标准曲线，计算酶活。
1个酶活单位定义为每毫升酶液每分钟释放1μmol/L的邻硝基苯酚，酶活力按公式(4)计算：
[eta-半乳糖苷酶活力 (U / mL)=frac{V_{1} × c}{t × V_{2}} quad (4)]
式中：(V_1)为反应总体积(mL);(c)为邻硝基苯酚浓度(μmol/mL);(t)为反应时间(min);(V_2)为发酵液体积(mL)。
1.5 数据处理
试验结果以(ar{x} pm SD)表示，采用GraphPad Prism 8和SPSS 26.0进行统计分析，*P*<0.05为差异显著。
2 结果与分析
2.1 10种乳杆菌的生长曲线
10种乳杆菌在MRS培养基中均正常生长：培养2~6h处于对数生长期;培养6~10h，除植物乳杆菌与嗜酸乳杆菌外，其余菌株由对数生长期逐渐进入稳定期;12h后，10种乳杆菌均进入生长稳定期。
2.2 核桃不溶性膳食纤维对乳杆菌增殖的影响
核桃不溶性纤维仅对植物乳植杆菌有促进作用，且促进作用随添加量呈先升高后降低趋势，0.8g/L时促进率最大(9.95%);对其余9种乳杆菌均有不同程度抑制作用，3.2g/L时抑制率均超20%，对唾液联合乳杆菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种的抑制率均超40%。
植物乳植杆菌含多种碳水化合物代谢相关基因，可发酵多种糖类，这是其能利用核桃不溶性纤维的重要原因;而其余9种乳杆菌缺乏相应代谢基因或水解酶，故未被促进，且纤维对乳杆菌的发酵效果也与纤维结构(链长、单体组成等)相关。
2.3 核桃可溶性纤维对10种乳杆菌生长的影响
核桃可溶性纤维对9种乳杆菌生长均有促进作用，且发酵程度显著高于不溶性纤维(可溶性纤维分子质量/聚合度更低，更利于微生物发酵)：1.6g/L时对植物乳植杆菌促进率最大(16.14%);3.2g/L时对干酪乳酪杆菌(11.23%)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(10.97%)、罗伊氏粘液乳杆菌(8.93%)促进率最高。
其中，唾液联合乳杆菌增殖效果最显著，3.2g/L时促进率达44.34%。乳杆菌对核桃可溶性纤维的利用存在菌种差异性，与核桃可溶性纤维的单糖组成(阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖等)相关，不同乳杆菌可利用的单糖种类不同，进而导致增殖程度差异。
2.4 核桃可溶性纤维对唾液联合乳杆菌增殖作用的评价
2.4.1 对增殖的影响
随着核桃可溶性纤维添加量增加，对唾液联合乳杆菌的促进率逐渐提升，活菌数与生物量均显著上升(*P*<0.05)，且呈浓度依赖性;3.2g/L时，生物量和活菌数分别较对照提高2.86倍和7.28倍。
2.4.2 对生物膜和非特异性吸附能力的影响
纤维添加量超0.8g/L时，可显著促进唾液联合乳杆菌生物膜的形成(*P*<0.05);3.2g/L时，唾液联合乳杆菌的表面疏水性显著提高8.81%，碱电荷显著降低(*P*<0.05)，酸电荷无显著变化。
表面疏水性升高可增强细菌黏附性，利于唾液联合乳杆菌在肠道定植并发挥作用;碱电荷降低则促进生物膜形成，可提高乳杆菌的耐干燥、耐热性，增强其环境适应性。
2.4.3 对发酵pH值、总糖与还原糖的影响
随核桃可溶性纤维含量增加，培养液pH值逐渐下降;培养12~48h，纤维组pH值显著低于对照组，3.2g/L时pH值最低(3.74)。培养0~6h，纤维组总糖浓度高于对照组;12h时，纤维组还原糖浓度低于对照组，表明核桃可溶性纤维可显著提高唾液联合乳杆菌对糖源的利用。
发酵液pH值降低与有机酸(乳酸、乙酸、丙酸、丁酸等)的产生相关，膳食纤维经乳杆菌发酵可生成多种短链脂肪酸，既降低pH值，又对人体健康有益。
2.4.4 对β-半乳糖苷酶和乳酸脱氢酶活性的影响
与对照组相比，核桃可溶性纤维可显著提高唾液联合乳杆菌β-半乳糖苷酶和乳酸脱氢酶的活性(*P*<0.05)。β-半乳糖苷酶可将核桃可溶性纤维中的半乳糖转化为低聚半乳糖，作为增殖因子被乳杆菌利用;乳酸脱氢酶活性提升则可提高乳酸产生效率，进一步促进乳杆菌增殖。
3 结论
本研究系统探究了不同浓度核桃不溶性、可溶性膳食纤维对10种乳杆菌生长的影响，结果显示：核桃不溶性膳食纤维仅能促进植物乳植杆菌生长，对其余9种乳杆菌均有抑制作用;核桃可溶性膳食纤维对供试的10种乳杆菌均有促进作用，其中对唾液联合乳杆菌的促进效果最显著，3.2g/L时促进率达44.34%。
进一步研究表明，核桃可溶性纤维可通过提高唾液联合乳杆菌β-半乳糖苷酶和乳酸脱氢酶的活性实现促增殖效果，同时还能显著提高该菌的生物量、活菌数和非特异性粘附能力，促进其生物膜形成，增强其对糖源的利用并降低发酵液pH值。研究结果为核桃可溶性膳食纤维作为新型益生元提供了理论支撑，也为核桃资源的高值化综合开发利用提供了新的思路和方向。
参考文献
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