所属栏目：医学校验论文范文发布时间：2013-06-18浏览量:188
通脉软胶囊为中药6类新药，已被SFDA批准进行临床研究。由人参、冰片等6味中药组成，具有益气化瘀、活血通脉的功能，主治冠心病、心绞痛等。为了保证产品的安全性、有效性及质量可控性，我们采用薄层色谱法对人参、冰片进行了定性鉴别。人参为方中君药，其主要成分为人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1等。为了更有效地控制产品质量，本文发表在《医学信息》上，文章建立用HPLC梯度洗脱法同时测定通脉软胶囊中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的含量[1-3]。结果表明，本法操作简便、重现性好、测定结果准确，能作为通脉软胶囊的质量控制的方法，是检验医学期刊发表范例。
1 仪器与试药
1.1 仪器
LC?2010A高效液相色谱仪(日本岛津),SPD?M10Avp二极管阵列检测器(日本岛津);BSZZ4S型电子分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)。
1.2 试药
人参皂苷Rg1对照品(批号:703?200221)、人参皂苷Re对照品(批号:754?200115)、人参皂苷Rb1对照品(批号:704?200318)均购自中国药品生物制品检定所;通脉软胶囊(自制，批号:060811、060812、060813，规格为0.6 g/粒)
2 方法与结果
2.1 通脉软胶囊的薄层鉴别
2.1.1 冰片 取本品2粒,剪开,置烧杯中,用水洗涤3次,每次15 mL,转入分液漏斗中,用正己烷萃取3次,每次15 mL,合并正己烷液,用甲醇20 mL萃取,弃去正己烷溶液,甲醇液蒸至约2 mL,转入5 mL量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,作为供试品溶液。取冰片对照品，加醋酸乙酯溶解，制成每1 mL含5 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VI B)试验，吸取对照品溶液及供试品溶液各1 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯?正己烷(体积比9∶3)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%磷钼酸溶液，热风吹至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，而阴性对照色谱中无相应斑点出现，见图1。
2.1.2 人参 取本品5粒，剪开，加温水(40～50 ℃)洗涤3次，每次15 mL，加乙醚30 mL洗涤，并入分液漏斗中，弃去乙醚液，再加乙醚30 mL萃取，弃去乙醚液，水溶液加水饱和正丁醇萃取4次(20 mL，20 mL，15 mL，15 mL)，合并正丁醇液，加1% NaOH溶液洗涤2次，每次30 mL，弃去碱液，再加用正丁醇饱和的水溶液洗涤2次，每次20 mL，收集正丁醇液，置蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液。取人参皂苷Rg1和Re对照品，加甲醇制成每 mL各含0.5 mg的混合溶液，作为对照品溶液。另取人参对照药材1 g，加三氯甲烷40 mL，加热回流1 h，弃去三氯甲烷液，药渣挥干溶剂，用水0.5 mL拌匀湿润后，加水饱和的正丁醇10 mL，超声处理30 min，吸取上清液，加3倍量氨试液，摇匀，放置分层，取上层液蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VI B)试验，吸取对照品溶液、对照药材溶液各4 μL及供试品溶液6 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷?甲醇?水(体积比13∶7∶2)10 ℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃烘约5 min。供试品色谱中，在与对照品色谱、对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性色谱中无对应斑点出现，见图1。
1-3.供试品;4.人参对照药材;5.人参皂苷Rg1对照品;6.人参皂苷Re对照品;7.缺人参的阴性对照
Fig.1 TLC chromatogram of borneol and Panax ginseng2.2 人参皂苷的含量测定#p#分页标题#e#
2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取以五氧化二磷干燥至恒重的人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品、适量，加甲醇制成每1 mL各含0.5 mg的混合溶液，混匀即得(浓度分别为：人参皂苷Rg1 0.596 mg/mL;人参皂苷Re：0.452 mg/mL;人参皂苷Rb1：0.548 mg/mL)。
2.2.2 供试品溶液的制备 取本品5粒，剪开，加温水(40～50 ℃)洗涤5次，每次10 mL，加乙醚20 mL洗涤，并入分液漏斗中，弃去乙醚液，再加乙醚20 mL萃取，弃去乙醚液，水溶液用水饱和的正丁醇提取5次(20 mL，20 mL，20 mL，15 mL，15 mL)，合并正丁醇液，用1%氢氧化钠溶液洗涤2次，每次20 mL，弃去碱液,再用正丁醇饱和的水洗涤2次,每次20 mL，收集正丁醇液，置蒸发皿中蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过, 作为供试品溶液。
2.2.3 阴性样品溶液的制备 按处方比例分别称取除人参外其他药材适量,按软胶囊制备工艺制得缺人参的阴性样品,照供试品溶液制备项下方法制备阴性样品溶液。
2.2.4 色谱条件与系统适用性试验[2] 色谱柱：Hypersil BDS C18(200 mm×4.6 mm,5 μm)色谱柱(大连依利特);流动相：乙腈(A)?水(B)梯度洗脱(B%为80→72→70→80，相应时间周期为0→60→100→120 min);流速：1.0 mL/min;检测波长：203 nm;柱温：30 ℃。理论塔板数按人参皂苷Rg1峰和人参皂苷Rb1峰计算应分别不低于5 000。
分别吸取供试品溶液、阴性对照溶液及对照品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件进行测定。记录其HPLC液相色谱图，结果表明人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1色谱峰分离良好,且阴性样品溶液无干扰,见图2。
2.2.5 线性关系的考察 分别精密吸取对照品溶液4、8、10、16、20 μL,按上述色谱条件,测定峰面积。以色谱峰峰面积为纵坐标,对照品进样量为横坐标,绘制标准曲线并进行线性回归,得回归方程为：人参皂苷Rg1：A=285789.9m+9904.24，r=0.999 6; 人参皂苷Re： A=239735.86m+19055.7，
r=0.999 5;人参皂苷Rb1：A=203251. 68m+11271.2，r=0.999 8。结果表明, 人参皂苷Rg1在2.384～11.92 μg范围内, 人参皂苷Re在1.808～9.04 μg范围内, 人参皂苷Rb1在2.192～10.96 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。
HPLC chromatograms of reference substances of ginsenosides Rg1, Re, Rb1(A)，Sample(B), and negative control(C)2.2.6 精密度试验 精密吸取对照品溶液10 μL, 注入液相色谱仪，连续测定6次，测得峰面积，计算峰面积积分平均值得：人参皂苷Rg1为1 568 929.4，RSD为1.51%;人参皂苷Re为1 179 013.6，RSD%=1.84%;人参皂苷Rb1为1 229 651.6，RSD为1.68%。结果表明：精密度均良好，符合定量分析要求。
2.2.7 稳定性试验 精密吸取供试品溶液10 μL,分别在制备后0、0.5、1、2、4、6、8 h进样,测定色谱峰峰面积, 计算峰面积积分平均值得：人参皂苷Rg1为1 777 943.4，RSD为1.53%;人参皂苷Re为757 386，RSD%=1.86%;人参皂苷Rb1为1 740 510.7，RSD为1.89%。表明样品溶液在8 h内测定结果稳定。
2.2.8 重复性试验 分别取同一批供试品6份,按“2.2.2”项下方法制备溶液,依法测定，计算平均含量为：人参皂苷Rg1为0.6452 mg/粒，RSD为1.69%;人参皂苷Re为0.3127 mg/粒，RSD%为1.93%;人参皂苷Rg1+Re为0.9680 mg/粒，RSD为1.98%;人参皂苷Rb1为0.6451 mg/粒，RSD为1.91%。表明本方法重复性良好。
2.2.9 回收率试验 精密称取人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1对照品适量，加甲醇分别制成每1 mL含人参皂苷Rg10.432 4 mg、人参皂苷Re 0.216 0 mg、人参皂苷Rb1 0.410 0 mg的溶液备用。
取本品2粒，剪开，将内容物倾出，置烧杯中，精密加入上述人参皂苷对照品溶液各3 mL，按“2.2.1”项下方法进行样品处理及测定，计算回收率，结果见表1。
2.2.10 样品含量测定 分别精密称取3批样品, 按“2.2.1”项下方法制备,依法进样测定，结果见表2。 表1 加样回收率试验测定结果表2 3批样品的含量测定结果
3 讨 论
3.1 通脉软胶囊按《中国药典》(2000年版一部)规定，仅测定了人参皂苷Rg1、人参皂苷Re的含量。本文以《中国药典》(2005年版一部)中[人参]项下的高效液相色谱方法为基础,对通脉软胶囊中3个人参皂苷进行了含量测定, 并分别进行了方法学考察，结果表明在本文介绍的供试品制备方法和色谱条件下，同时测定人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1，色谱峰分离完好，所建立的方法可以作为通脉软胶囊的质量控制方法。
3.2 色谱柱、柱温的影响
比较了大连依利特不同型号的色谱柱对测定结果的影响，发现Hypersil BDS C18柱分离较好，基线基本稳定，人参皂苷Rg1、人参皂苷Re能达到基线分离，而人参皂苷Rb1也能与相邻峰达到分离度的要求。最终选择大连依利特Hypersil BDS C18色谱柱。
在所选择的梯度洗脱程序条件下，分别试验了不同柱温对人参皂苷保留值及分离度的影响。在25 ℃条件下，由于流动相的黏度太大，造成柱压升高，基线出现漂移。45 ℃时柱温过高，Rg1、Re分离度变差不能满足定量要求;在30 ℃条件下，人参皂苷的分离度能满足定量要求，故选择30 ℃为柱温。
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