畜禽肌纤维发育相关细胞种类及鉴定方法的研究进展

所属栏目：畜牧论文范文发布时间：2026-01-08浏览量:793

　　论文《畜禽肌纤维发育相关细胞种类及鉴定方法的研究进展》发表在《畜牧兽医学报》，版权归《畜牧兽医学报》所有。本文来自网络平台，仅供参考。

　　摘要

　　肌细胞(又名肌纤维)是组成骨骼肌的基本单位，约占畜禽机体的50%左右，与畜禽产肉性能、骨骼保护密切相关，对调节畜禽机体代谢和内分泌有重要作用，同时也为畜禽的运动提供了动力。骨骼肌是一种较为复杂的组织，组成这些组织的基本单位是肌细胞，骨骼肌在发育时期需要多种类型的单核和多核细胞相互作用，这是形成优质肉类的关键。近些年，随着科学技术的快速发展，对鉴定骨骼肌发育相关细胞有了更多且全面的技术，而单细胞测序技术在其中运用最为广泛，它的运用为组成骨骼肌的细胞类型和相关细胞发育异质性的研究提供了技术支持，对肉品质的研究有重大意义。本文综述了通过细胞形态学观察、分子标记物、免疫组织化学、免疫荧光、原位杂交、单细胞测序的方法鉴定与骨骼肌发育过程相关的细胞，归纳与骨骼肌发育相关细胞的标记基因，为了解骨骼肌的结构和功能、探索骨骼肌发育机制提供参考，为肉品质的研究提供理论基础，也在不同品种的个体选育中具有重要意义和实践价值。

从细胞结构上,骨骼肌发育分为两个阶段

　　关键词

　　骨骼肌;骨骼肌发育;细胞鉴定

　　1 骨骼肌纤维概述

　　1.1 骨骼肌纤维发育阶段

　　从细胞结构上，骨骼肌发育过程可分为两个不同的阶段：首先是在早期的胚胎时期，骨骼肌细胞数量的增加;其次是在生长的后期，主要是肌纤维的肥大发育和肌纤维类型的转化[4-5]，从而促进肌肉发育进入细胞增生期(以绒山羊为例，如图1所示)。其中的一些蛋白质和转录因子作为调节因子，在胚胎骨骼肌的发育过程和肌肉分化中发挥重要作用。

　　从细胞组成上，骨骼肌是由中胚层间充质干细胞发育而来，直到形成最成熟的肌肉组织，该过程极为复杂，大致可分4个阶段[6-7]：

　　1. 第一阶段：中胚层间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)发生终末分化(terminal differentiation)而形成体节，体节成对排列在胚胎神经管的两侧[8]，体节可分化为软骨细胞、成血管细胞、成纤维细胞以及成肌细胞，成肌细胞是骨骼肌的前体细胞，即单核成肌细胞(myoblast)的形成;

　　2. 第二阶段：单核成肌细胞发生融合，形成肌管(myotube)，肌管是含有肌原纤维的长圆柱状的多核细胞[9];

　　3. 第三阶段：肌管进一步分化而形成肌纤维[10];

　　4. 第四阶段：肌纤维继续生长直到最终发育为成熟的肌肉组织[11-12](如图2所示)。

　　1.2 不同物种骨骼肌发育阶段

　　有研究表明，不同畜禽中骨骼肌发育过程基本相似，但在发育阶段的时间上具有一定的特异性：

　　鸡：出生后第7胚龄肌纤维主要由慢肌纤维构成，到第14胚龄左右快肌纤维开始作为主导类型，随着胚龄增加，肌内纤维直径和横截面积逐渐变大但纤维密度越来越小，且腿肌比胸肌发育更迅速[13];

　　小鼠：胚胎发育过程可分为两个阶段，10.5~12.5 d为初级期或早期胚胎期，14.5~17.5 d为次级期或胎儿后期[14];

　　牛：到180 d时，肌原细胞在第2代时分化结束，纤维总数定型;

　　绵羊：李雪娇等[15]对德美羊和中美羊两个品种的胎儿期骨骼肌发育进行对比，确定105 d是绵羊肌纤维从数量增多到增粗转变的关键节点;有文献指出在绵羊、牛和人40%的妊娠期中检测到了三代肌原细胞，推测山羊出现三代肌原纤维的时期可能在57~64 d之间;

　　猪：初级纤维形成发生在妊娠第35~55天，由前体成肌细胞向肌管整合完成;55~90 d初级纤维周围的次生纤维开始增殖[16];三级肌纤维通常在产后早期发育而成，直径往往小于初级和次级肌纤维;在末代肌纤维形成过程中，肌纤维总数基本没有改变[17]。

　　但动物妊娠期无法准确划分骨骼肌发育阶段，无法反映不同物种之间的差异[18](如图3所示为不同物种肌原细胞发育时间线)。

　　1.3 组成肌纤维的类型及转化

　　肉品质与肌纤维类型密切相关，肌纤维类型的组成是调控肉品质的关键。畜禽随着生长发育阶段的不同，肌纤维会随着年龄增加逐渐成熟，体积增大，类型也会随之发生转化，用以满足机体的运动、代谢等生命活动[19]。

　　根据肌纤维收缩类型分为慢收缩Ⅰ型(慢肌)和快收缩Ⅱ型(快肌)：慢肌多为红肌纤维组成，又名氧化型肌纤维;快肌多为白肌纤维组成，又名酵解型肌纤维[20]。在慢肌和快肌的基础上，按MYHC亚型被分为I、IIa、IIx、IIb四类：I(慢速氧化型)型即为慢肌，Ⅱ型为快肌，Ⅱ型又可分为IIa型(快速氧化糖酵解型)、IIb型(快速糖酵解)和IIx型(快速糖酵解)。IIx作为中间型，其功能及代谢能力介于IIa和IIb之间，收缩速率从大到小依次为IIb、IIx、IIa、I[21]。

　　已有研究表明[22]，I型纤维比IIb型纤维直径细、剪切力小，具有良好的嫩度特性;同时I型纤维比Ⅱ型纤维含有更多脂质和磷脂，肉质风味好。不同肌肉群中具有不同比例的纤维类型：杨玉莹等[23]通过对不同部位牦牛肌纤维特性进行研究，发现背最长肌和半膜肌Ⅱ型肌纤维比例较高，腰大肌I型肌纤维的比例较高。

　　肌纤维类型也随畜禽不同发育阶段有不同的组成：出生时，肌肉主要由氧化型肌纤维组成;出生后生长阶段，氧化型肌纤维的比例减少同时酵解型肌纤维的比例增加[24]，并遵循Ⅰ↔Ⅱa↔Ⅱx↔Ⅱb的变化规律[25]。例如，通过对蒙古马胎儿期与成年期骨骼肌肌纤维类型进行比较发现，胎儿期Ⅱ型肌纤维占比相较成年时期更大，发育到成年时期时，肌纤维由Ⅱ型(快型)纤维向Ⅰ型(慢型)纤维转化[26];周力等[27]对出生和12月黑藏羊背最长肌肌纤维进行分析得到，随着发育时间的推移，其肌纤维类型由氧化型开始向酵解型转化，这在一定程度上影响着机体生长发育。

　　2 主要肌纤维细胞Marker基因的概述

　　组成骨骼肌的细胞有肌细胞(myocyte)、内皮细胞(endothelial cell)、成纤维细胞(fibroblasts)、间充质干细胞(mesenchymal stem cell)、免疫细胞[B细胞、T细胞、巨噬细胞(macrophages)]、中性粒细胞(neutrophils)、卫星细胞(satellite cell)、神经胶质细胞(glial cell)、纤维/成脂祖细胞(fibro-adipogenic progenitors, FAPs)、平滑肌细胞(smooth muscle cell)等[28-29]。根据前人的大量研究，可将骨骼肌发育的主要细胞类群归纳为内皮细胞、骨骼肌肌源性亚群(成肌细胞、肌细胞、肌源性祖细胞等)、免疫细胞、纤维/成脂祖细胞等。

　　2.1 内皮细胞

　　内皮细胞(endothelial cells, ECs)遍布血管中，是氧气和营养物质输送、免疫细胞运输以及清除远组织废物的重要管道[30]。ECs可以调节血流、血浆中大分子的传递和血管舒缩，防止血细胞的黏附和血栓形成，维持血管屏障功能[31]。有研究表明，在胚胎细胞群中只有一小部分包括内皮细胞和心肌中少于50%的心肌细胞群(包含肌细胞)[32]。

　　血小板内皮细胞黏附分子-1(PECAM1)，也称为CD31，是一种参与淋巴细胞活化和跨内皮迁移的细胞黏附分子，负责血管内皮细胞单层的形成，PECAM1(CD31)是内皮细胞的marker基因[33]。CD34也是标记内皮和血管周围细胞的特异性基因[34]，是用于识别各种组织中的血管祖细胞的基因，在维持组织稳态中起着关键作用。

　　2.2 免疫细胞

　　免疫细胞是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞，包括淋巴细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞等。研究表明，在肌肉损伤后免疫细胞的比例会增加，帮助清除坏死细胞并促进再生。其中，巨噬细胞扮演着中心角色，它们通过调控细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的组织恢复和重构，有助于维持组织的稳定性[35]。

　　B细胞包括骨髓中的祖细胞、淋巴组织中处于发育状态的B细胞以及淋巴和非淋巴组织中终末分化的记忆B细胞和浆细胞，它们通过产生针对特定身体部位的抗体，在体液免疫中发挥核心作用，参与机体的免疫系统[36]。

　　Xu等[37]使用scRNA-seq对新生仔猪骨骼肌细胞群进行分析，共定位到9个细胞群，其中用基因PTPRC和CD3G对淋巴细胞进行了定位，揭示了细胞异质性、新的细胞亚群及其相互作用的变化。Zhao等[38]通过利用癌症基因组图谱数据挖掘了9个B细胞标记基因ZBP1、SEL1L3、CCND2、TNFRSF13C、HSPA6、PLPP5、CXCR4、GZMB和CCDC50。Coulis等[39]得到巨噬细胞的标记基因有Folr2、Mt2、Lyvel和Gas6等。

　　2.3 成纤维细胞

　　结缔组织的主要细胞类型是成纤维细胞，它在组织发育、稳态、修复和疾病过程中分泌细胞外基质成分[40]，在正常情况下不表达α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle-actin, α-SMA)。成纤维细胞在皮肤真皮层中最为丰富，此外还存在于肠、肺、心脏和肌肉等组织中。研究者们为区分不同的组织来源，一般把来自不同组织器官的成纤维细胞分别命名为“组织名称+成纤维细胞”，例如皮肤成纤维细胞、结肠成纤维细胞、滑膜成纤维细胞、肺成纤维细胞、肌肉成纤维细胞等[41]。

　　Fan等[42]对人的脐带和包皮间充质干细胞进行单细胞转录组测序，分析了所有细胞亚群中常见成纤维细胞的标记基因有ACTA2、FAP、PDGFRA、PDGFRB、COL1A1、POSTN、DCN、COL1A2、CDH11等。成纤维细胞的占比在不同种类肌肉和不同发育阶段有明显差异(如表1所示)。

　　2.4 纤维/成脂祖细胞

　　纤维/成脂祖细胞(FAPs)，也被称为肌肉常驻间充质祖细胞，具有多种分化潜力，可用于脂肪形成、纤维化、成骨和软骨形成，是肌肉内稳态和保持细胞完整性的关键调节器。纤维/成脂祖细胞通过协调肌肉干细胞(muscle stem cell, MuSCs)和免疫细胞之间的相互作用，在肌肉发育和修复中发挥重要作用。研究表明，FAP不仅在再生过程中促进短暂的肌肉纤维化和脂肪形成，而且还调节卫星细胞[43]。Wosczyna等[44]在小鼠上证明，体内FAP可防止卫星细胞过早分化，从而促进再生早期阶段卫星细胞的增殖。Chen等[45]研究表明，FAPs已被认为是维持肌肉内稳态的重要调节因子。

　　FAPs有时也被称为成纤维细胞，“成纤维细胞”作为一个总括术语，用来描述包括分化细胞和成体祖细胞在内的细胞类型的异质群体。为了避免语义混淆，使用术语“肌成纤维细胞”来表示由成年祖细胞(如FAPs)产生的不同分化的细胞，该祖细胞产生细胞外基质[46]。有研究表明，PDGFRAα是纤维/成脂祖细胞的标志物，PDGFRα⁺细胞能够有效分化成脂肪细胞[47-48]。

　　2.5 骨骼肌肌源性亚群

　　已有研究发现在牛胚胎期时，发育的骨骼肌肌源性亚群以MYF5⁺成肌细胞、MYOG肌细胞为主，也观察到少量表达PAX7的肌源性祖细胞亚群。在出生后阶段，几种类型的肌纤维构成了肌源性群体的大部分，没有检测到分化的肌源性细胞。在成年期，骨骼肌主要由慢速肌纤维和快速肌纤维构成，这些纤维可以进一步细分为I型纤维、IIA型纤维以及IIX型纤维[49]。

　　肌肉卫星细胞(satellite cells, SCs)又名成体干细胞，位于肌纤维基底板和肌膜之间，通常保持静止状态，是维持骨骼肌稳态的核心细胞。骨骼肌的再生和修复能力依赖于卫星细胞和其他细胞(如免疫细胞、内皮细胞、成纤维细胞等)之间的相互作用[50]。在稳定的肌肉结构中，静止卫星细胞的占比不足10%，并且在不同的肌肉组织中，静止卫星细胞的数量表现出明显的差异性，与慢肌纤维有关的卫星细胞数量多，而与快肌纤维有关的卫星细胞则相对较少[51]，但在损伤和再生过程中会增多。

　　PAX7是卫星细胞的特异性表达转录因子，有研究表明，PAX7的产生使成人的卫星细胞能够进行诱导性基因标记和消融，并证明卫星细胞对肌肉再生既是必要的，也是充分的[52]。静止的卫星细胞通常表达诸如基因Pax7和Myf5等标记物，肌肉损伤之后卫星细胞会被损伤环境所发出的多种信号所激发，然后向损伤部位迁移，并重新进入细胞周期进行增殖。在这个发展阶段，共同生成的卫星细胞被命名为成肌细胞，并且它们表达了肌原性标记物Pax7和/或Myf5和/或MyoD。增殖期过后，成肌细胞从细胞周期中撤出并向成熟肌细胞分化，在这个分化过程中，基因Pax7和Myf5的表达水平下降，同时基因MyoG和Mrf4的水平也有所上升(如图4所示)。

　　骨骼肌纤维的生长发育进而形成肌肉的过程需要成肌细胞的增殖和分化，而骨骼肌纤维的形成受肌卫星细胞的分化增殖等复杂过程调控，其中生肌调节因子(myogenic regulatory factors, MRFs)家族被认为是启动和促进骨骼肌卫星细胞分化增殖的关键调控因子，在骨骼肌的生长发育过程中发挥着至关重要的作用。MRFs是由四种肌肉特异性蛋白组成的，包括MyoD、Myf5、MyoG、Mrf4[53]。

　　肌细胞生成素(MyoG)属于生肌调节因子家族(MRFs)的一员，它是决定肌细胞终末端分化的核心因子，并在调节肌细胞生成过程中发挥中心角色，其表达还能终止成肌细胞增殖并调控单核成肌细胞向多核肌细胞整合的进程。MyoG作为生肌调节因子家族的主要成员之一，调节中胚层向肌纤维的分化过程，进而通过成肌细胞向肌纤维的整合过程。MyoG基因是MRFs基因家族中唯一在所有骨骼肌肌细胞系中均可表达的基因[54]。

　　2.6 SCX⁺细胞

　　SCX的表达标记了一个干细胞祖细胞群体，产生软肌骨骼细胞(肌细胞、半月板细胞、腱细胞)和硬肌骨骼细胞(软骨细胞和骨细胞)，对肌腱和韧带的正常发育和成熟至关重要，同时可能参与后肢骨骼肌发育[55]。SCX高表达肌腱细胞标记物，通过单细胞转录组测序技术结合质谱流式细胞术确定了两个肌肉常驻细胞群，基因TNMD、THBS4和EGR1定位了间质肌腱细胞[56]。

　　成熟的肌腱由大量的胞外基质组成，胞外基质由胶原纤维和蛋白聚糖构成[57]。有研究发现，TNMD也名腱调蛋白，是一种II型跨膜糖蛋白，分布在肌腱、韧带及骨骼肌的肌外膜中，是肌腱分化的特异性标志。而肌腱标记基因SCX能够正向调控TNMD的表达。在鸡骨骼肌发育的早期阶段，基因SCX的表达早于TNMD，并且SCX的存在促进了TNMD的表达[58]，这表明SCX对多个胞外基质成分具有调控作用。

　　3 骨骼肌中不同类型细胞相互作用

　　骨骼肌中不同细胞的相互作用是一个复杂的动态过程，各类细胞通过分泌多种信号分子和细胞间直接接触，共同维持肌肉的健康与功能。

　　间充质干细胞(MSCs)是一种多能性组织干细胞，可分化为多种中胚层组织类型，包括成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞和肌成纤维细胞[59]。周细胞(pericyte, PC)长期以来被视为血管的结构性细胞，然而，随着对它们与内皮细胞紧密接触的识别，以及通过旁分泌信号与周围细胞的相互作用，逐渐揭示出周细胞在维持血管周围环境稳态方面的其他重要功能[60]。

　　有研究表明，纤维/成脂祖细胞(FAPs)不仅在再生过程中促进短暂的肌肉纤维化和脂肪形成，而且还调节卫星细胞、巨噬细胞，并且是调节性T细胞的分泌信号的重要来源[61-62]。还有研究发现，在肌肉损伤中，免疫细胞(尤其是巨噬细胞)会被招募到受损区域，促炎M1巨噬细胞和抗炎M2巨噬细胞对卫星细胞分别进行调控，这种相互作用对于有效修复肌肉至关重要[63]。

　　Ahmad等[64]研究得到牛肌肉组织中含有成纤维细胞的条件培养基可以增加培养中的成肌细胞的增殖，说明成纤维细胞不仅可以通过细胞外基质的形成来调节卫星细胞的激活，还可以作为生长因子的旁分泌来源。不同细胞之间通过细胞因子、化学信号和直接接触进行相互调节。研究表明，IGF-1和FGF等生长因子在卫星细胞的增殖和分化中起重要作用，同时也激活PI3K/Akt信号通路来调控成肌细胞的增殖分化[65]。对这些相互作用的深入研究不仅有助于理解肌肉生物学，也为治疗肌肉相关疾病提供了潜在的新方向。

　　4 不同畜禽骨骼肌细胞类型组成

　　骨骼肌发育相关的细胞类型与不同畜禽、不同发育阶段以及不同组织部位等因素密切相关(如表1所示)。根据前人的研究表明：

　　牛：胚胎期成纤维细胞占比最多，肌细胞次之;哺乳期内皮细胞占比最多，其次是IIX型肌纤维、I型肌纤维和周细胞;成年期IIX型肌纤维占比最多，其次是肌腱细胞、IIA型肌纤维[102];

　　猪：1日龄新生猪背最长肌中内皮细胞占比最多，其次是肌管、纤维成脂祖细胞和卫星细胞[66];

　　鸡：生长早期(孵化后第5天)和快速生长期(第100天)的胸肌中，成肌细胞占比最多，其次是脂肪细胞[103]。

　　通过对不同细胞类型的研究可以更好地解析不同畜禽发育机制。

　　表1 不同畜禽骨骼肌中细胞类型组成的异同

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　　5 细胞鉴定方法

　　骨骼肌的发育是一个动态且复杂的过程，从胚胎期到胎儿期再到出生后期，需要多种细胞相互作用、相互配合，共同完成。对不同发育阶段肌肉组织的细胞鉴定是更好地理解肌肉发育、再生以及疾病等生物过程的关键。根据不同的研究阶段和目的，研究者们采用多种细胞鉴定方法联合分析，以下概述多种鉴定方法在肌肉发育中的应用。

　　5.1 细胞形态学鉴定

　　细胞形态学分析是最直接的细胞鉴定方法之一，通过观察细胞的形态、大小、颜色、核形态等特征，可以初步确定细胞的类型。在细胞形态学分析中，可以使用光学显微镜或电子显微镜来观察和记录细胞的形态特征。

　　石蜡切片和HE染色是组织学中最基本的技术之一，至今已使用了一百多年[67]。石蜡切片是常规切片技术中应用最为广泛的技术之一，其优点是切片的厚度容易控制(最薄可达0.15μm)，清晰度较好，在显微镜下可以观察到组织形态，从而判断其细胞类型[68]。苏木精-伊红(HE)染色作为组织学常用的染色技术，能够突出细胞和组织的精细结构，从而对细胞类型进行观察与分析[69]。

　　HE是最常见且简单的染色方法，因为它适合多种固定物，并显示出细胞质、细胞核和细胞外基质的普遍特征。苏木精呈深蓝紫色，通过复杂的反应染色核酸;伊红是粉红色的，可非特异性地染色蛋白质。在组织中，细胞核被染成蓝色，而细胞质和细胞外基质有不同程度的粉红色[70]。

　　石蜡切片结合HE染色可以更好地观察到不同发育时期不同组织或细胞的形态结构，是研究不同组织和细胞形态最有效的工具。有很多研究将HE染色和其他免疫细胞化学染色技术结合起来用来鉴定细胞类型：Chen等[71]通过HE和免疫荧光染色，检测到了来自于脂肪组织中的微小神经纤维细胞和雪旺细胞;Hao等[72]通过使用HE染色法，观察到CV8穴位的形态学特征，将HE染色和免疫组化染色相结合鉴定了CV8穴位的细胞类型。

　　5.2 分子标记物鉴定

　　生肌调节因子(myogenic regulatory factor, MRF)，又称为MyoD家族，仅在骨骼肌中表达[73]，它可以诱导成纤维细胞、卫星细胞分化为成肌细胞，参与调控肌肉生长发育[74]。其由四个家族成员组成，分别是MyoD、myogenin、Myf5和MRF4(Myf-6或herculin)：Myf5能促进肌纤维形成[75]，是卫星细胞的关键细胞标志物之一，在肌肉损伤再生中起着重要作用[76];MyoG和Mrf4参与肌管融合及肌细胞分化[77]。在胚胎发育过程中MRF家族具有特定的时空表达模式，myf-5、myogenin、MRF4和MyoD分别于胚胎形成第8、8.5、9、10.5天表达[78]。

　　5.3 免疫细胞化学染色

　　免疫细胞化学染色是一种常用的细胞鉴定方法，通过使用特异性抗体标记目标蛋白质，可以在细胞中检测到特定的抗原表达。这种方法可用于确定细胞的类型和功能，以及检测细胞中特定蛋白质的表达量和定位，主要分为免疫荧光和免疫组化两方面。

　　5.3.1 免疫荧光

　　免疫荧光(IF)是一种重要的免疫化学技术，可以检测和定位各种细胞制剂的不同类型组织中的各种抗原。根据实验的范围或使用的特异性抗体不同，有两种方法可用：直接(初级)或间接(次级)[79]。很多研究者在研究细胞时都会将免疫荧光作为后期的验证实验：Feng等[80]通过使用Pax7基因针对小鼠肌肉组织，且在斑马鱼肌肉研究的基础上优化了免疫荧光染色方案，对卫星细胞进行了标记;Dumont和Rudnicki[81]用Pax7、MyoG基因对小鼠腿部肌肉进行免疫荧光试验，用来验证骨骼肌再生肌原细胞。

　　5.3.2 免疫组织化学

　　免疫组织化学(IHC)是应用最广泛的蛋白质检测技术之一，该技术的原理是基于特异性抗体与组织中匹配的特异性抗原的结合，使用一系列检测技术使结合的抗原-抗体复合物可视化。IHC使用多种不同的酶标记物(例如过氧化物酶和碱性磷酸酶)来检测感兴趣的抗原[82]。有研究表明，在某些情况下，这些组织化学染色在特定的细胞鉴定中具有关键价值[83]：Cefis等[84]通过使用免疫组化技术研究大鼠比目鱼肌(soleus, SOL)和腓肠肌(gastrocnemius, GAS)中脑源性神经营养因子(BDNF)在细胞中的定位;Kalbe等[85]通过进行免疫组织化学分析，确定肌肽相关蛋白的细胞定位，研究肌肽对从糖酵解肌纤维和氧化肌纤维中分离出的成肌细胞的增殖生长的影响。

　　5.4 荧光原位杂交

　　荧光原位杂交(FISH)为研究不同生物背景下基因和细胞的空间定位和表达水平提供了宝贵的工具，广泛用于特定DNA片段(和RNA片段)的视觉定位，适用于细胞周期任何阶段的染色体或细胞核[86]。使用单分子RNA原位杂交的方法可以更好地理解特定基因在亚细胞中的定位[87]。

　　RNA FISH是一种能够检测和可视化细胞内特定RNA分子的技术，随着技术的进步，其灵敏度和特异性得到了提高，可以检测单个mRNA分子。该技术使用一组荧光标记的探针检测RNA，这些探针与感兴趣的基因对应的特定核苷酸序列互补，与目标RNA分子杂交后，能够同时检测同一细胞或组织内的多个RNA，鉴定基因在细胞内的表达情况[88]。Lawrence等[89]通过对体外分化的鸡骨骼肌成肌细胞进行原位杂交，直接在单个细胞内分析肌肉特异性mRNA的表达，获得了关于这些基因在单个细胞中表达的精确信息。

　　DNA FISH是一种常用的分子技术，用于可视化DNA序列的位置[90]，其核心原理是荧光标记的DNA探针(双链或单链DNA片段)在细胞或组织中原位结合其互补序列的能力，以荧光显微镜可检测的荧光信号的形式揭示其靶标的位置[91]。

　　5.5 流式细胞术

　　流式细胞术是一种高通量的细胞分析方法，通过标记细胞表面和内部的特定标记物(如抗体或荧光染料)，可以在流式细胞仪中对细胞进行快速准确的分析和鉴定。该技术可用于细胞的多参数分析(如细胞大小、形态、表面标记物等)，快速鉴定不同细胞类型。通过单染流式细胞计量分析可检测包括肌动蛋白、肌球蛋白、原肌球蛋白和α-肌动蛋白在内的蛋白质;肌纤维类型可以通过骨骼肌肌动蛋白和不同肌球蛋白的双重标记流式细胞术来确定。流式细胞术能够用多种抗体同时标记整个肌肉样本，在某些应用中比传统方法更具有优势[92]。

　　相关研究案例：Kosmac等[93]通过流式细胞术验证得出可以明确识别出人类骨骼肌的巨噬细胞群体;Gattazzo等[94]使用流式细胞术概述了肌原细胞从出生到成年的异质性和动态，更好地理解肌原细胞在分化过程中的进展，并证明了这一过程具有复杂的肌原细胞状态多样性的特征;Čamernik和Zupan[95]提出使用流式细胞术来准确定量间充质干细胞/基质细胞(MSCs)表面抗原;Krasniewski等[96]通过流式细胞仪分析证实了骨骼肌(skeletal muscle, SKM)中4个巨噬细胞亚群的存在;Montarras等[97]通过流式细胞术从成年骨骼肌中直接分离出表达(Pax3)的肌肉卫星细胞;Luk等[98]使用基于图像的流式细胞术和细胞微量染料来监测卫星细胞的增殖，并识别卫星细胞分化的不同阶段;Percopo等[99]通过流式细胞术挖掘出一种可以用来定量和检测嗜酸性粒细胞，并从受过敏原感染的野生型和未受感染的小鼠的骨髓、脾和肺组织中分离出嗜酸性粒细胞的方法。

　　从前人研究可以看出，使用流式细胞术可以很好地将目的细胞与其他细胞分离开，并可以监控细胞分化的情况。

　　5.6 单细胞测序

　　单细胞转录组测序(scRNA-seq)技术在对生物机体发育的分子机制和细胞程序的研究中，逐步实现了从单细胞水平研究生物发育的目的。

　　相关研究案例：Coulis等[100]通过利用单细胞和空间转录组技术对骨骼肌纤维化巨噬细胞进行研究，发现了6个不同巨噬细胞簇，确定了一种与纤维化相关的营养不良肌肉巨噬细胞的独特转录谱;Giordani等[101]使用单细胞RNA测序和大量细胞术的结合方法，精确地绘制了成年小鼠肌肉中10种不同的单核细胞类型，发现了两个之前未被充分研究的细胞群(其中一种在体外表达转化因子并在体外产生肌腱细胞，第二种表达平滑肌和间充质细胞的标记物);Cai等[102]在牛骨骼肌中，通过scRNA-seq和scATAC-seq分析，在三个发育阶段发现了不同类型的细胞，如脂肪细胞、内皮细胞、成皮细胞、成纤维细胞、淋巴细胞、单核细胞、周细胞和8个骨骼肌生成亚群，并预测了与肌肉发育相关的特异性表达的转录因子;Li等[103]利用scRNA-seq在鸡的胸肌中鉴定出10个孵化后第5天发育阶段的细胞簇和7个发育后期第100天的细胞簇，在第5天发现了5个肌细胞相关簇和2个脂肪细胞簇，在第100天发现了1个肌细胞簇和1个脂肪细胞簇;De Micheli等[104]使用scRNA-seq技术，通过无监督聚类，共解析了16种来源于免疫、血管和基质的细胞，以及肌肉干/祖细胞(MuSCs)和一些肌纤维肌细胞核的两个不同亚群，为研究人类肌肉组织的异质性和识别疾病环境中MuSCs的多样性和失调的潜在靶点提供了参考;De Micheli等[105]一共鉴定了15种不同的细胞类型，包括肌肉干和祖细胞的异质群，通过配体-受体相互作用分析，确定了超过100对突变细胞和非肌原细胞之间与再生相关的旁分泌通信对，为研究肌肉再生过程中细胞通讯的相互作用提供了参考。

　　通过利用单细胞测序技术，可以更好地对肌肉组织细胞类群进行分类，深入研究细胞异质性，为进一步研究肌纤维发育提供有力的支持。

　　6 展望

　　随着现代科技分子生物技术的快速发展，细胞类型鉴定的方法多种多样，在单细胞转录组测序技术的支持下，利用标记基因鉴定细胞类群的方法运用最为广泛且准确。通过不同标记基因的方法鉴定与肌纤维发育过程相关的细胞，可大致将骨骼肌分为12多种细胞类型。肌纤维发育和分化是影响肉品质最重要的因素，深入探究其在不同发育阶段的细胞组成与变化十分必要。寻找与肌纤维数量、面积和脂肪沉积相关的细胞类型，发现与之相关的关键调控因子，可为进一步了解肌纤维发育提供理论依据。

　　随着人们生活水平的提高，追求好吃且健康的肉类成为趋势。根据不同畜禽骨骼肌发育的差异，未来可通过整合多组学的方法(将代谢组、蛋白组、表型组和空间转录组等互相组合)，更好地揭示不同状态或形态下畜禽骨骼肌发育情况，明确影响不同畜禽肉品质差异的分子调控机制;也可运用多组学的方法分析影响肌纤维发育相关的细胞通讯网络及通路，为进一步探究不同畜禽肉品质提供方向;还可通过机器算法，代入育种模型中，将理论与实践相结合，发现新的肌肉细胞标记和调控机制，为未来选育新品种提供参考。

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期刊论文出书

畜禽肌纤维发育相关细胞种类及鉴定方法的研究进展

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